Dear Microbe

Share Tweet Pin it

Sejak Pasteur, diketahui bahawa saluran gastrointestinal manusia pada dasarnya adalah bioreaktor jenis aliran dimana banyak mikroorganisma mendiami. Sikap saintis ke mikroflora usus pada masa ini telah berubah secara radikal. Seratus tahun yang lalu, Ilya Mechnikov yang terkenal, pengasas teori kekebalan moden, untuk penciptaan yang dia terima Hadiah Nobel (untuk dua dengan lawannya yang tidak dapat dipertanggungjawabkan, Paul Ehrlich yang kurang hebatnya), bahkan menawarkan untuk mengeluarkan usus besar sebagai salah satu cara untuk memanjangkan hayat. Dan bagi mereka yang ukuran ini kelihatannya terlalu radikal, saya mengesyorkan untuk meminum sebanyak mungkin kefir untuk menindas berbahaya, pada pendapatnya, mikrob yang mempunyai bakteria asid laktik yang bermanfaat. Selepas setengah abad, kursus ini telah berubah sebanyak 180 darjah. Ternyata mikroflora usus normal, serta kulit dan membran mukus, melakukan banyak fungsi berguna - sebagai contoh, ia menekan aktiviti penting mikroorganisma patogen yang sentiasa menyerang tubuh. Dan dalam beberapa tahun kebelakangan ini, ahli mikrobiologi yang paling berani telah pergi jauh, mengisytiharkan lelaki dan mikroba sebagai satu superorganisme simbiotik tunggal.

Pengembangan kaedah biologi molekul membawa saintis ke tahap baru memahami proses simbiosis manusia dan mikrofloranya, yang seolah-olah dipelajari dengan baik dan dari kajian yang tidak mengharapkan sebarang kejutan khusus. Pertumbuhan pesat dalam kelajuan dan kejatuhan kos kaedah penjujukan DNA (menentukan urutan nukleotida) dan peningkatan selari dalam kuasa komputer peribadi dan pembangunan Internet memungkinkan untuk menganalisis maklumat mengenai kawasan besar genom. Selepas kromosom beratus-ratus spesies bakteria individu telah diuraikan, pendekatan baru telah muncul dalam genetik mikroorganisma - pendekatan penduduk: menganalisis gen semua bakteria yang mendiami kawasan tertentu sekaligus. Sudah tentu, populasi "bioreaktor manusia" ternyata menjadi salah satu yang paling penting bagi kajian populasi mikrob.

Kerja pertama, yang membawa kepada penampilan baru pada mikrobiota usus, diterbitkan pada tahun 1999 oleh sekumpulan saintis dari Institut Penyelidikan Agronomi Nasional (Perancis) dan Universiti Reading (United Kingdom). Penulis memutuskan untuk menggunakan kaedah penjujukan gen 16S RNA untuk mengkaji populasi mikroba usus.

16S RNA - ID bakteria

Sejak Pasteur, langkah pertama dan perlu dalam penentuan mikroorganisma adalah penanaman mereka terhadap media nutrien. Tetapi banyak mikrob yang penting (dan bermanfaat, dan patogen) tidak mahu berkembang dalam mana-mana medium. Kajian sebelum ini tidak boleh diakses bakteria mempunyai tanam-tanaman dan mula untuk membersihkan taksonomi yang benar-benar mengelirukan prokariot dikenali menjadi mungkin dengan perkembangan bioinformatik dan kedatangan teknik biologi molekul moden - polymerase chain reaction (PCR), yang membolehkan sekeping DNA untuk mendapatkan berjuta-juta dan berbilion-bilion salinan yang sama, klon diasingkan daripada menggunakan gen PCR dalam plasmid bakteria dan teknik penjujukan untuk urutan nukleotida yang diperoleh hasil daripada semua ini cukup untuk Iza jumlah.

Penanda yang ideal untuk mengenal pasti mikroorganisma ialah pengekodan gen 16S ribosom RNA (setiap satu daripada dua subunit bengkak sel ribosom untuk sintesis protein - terdiri daripada molekul protein tersambung dan rantai asid ribonukleik).

Gen ini berada dalam genom semua bakteria dan arkea yang diketahui, tetapi ia tidak hadir dalam eukariota dan virus, dan jika anda mendapati urutan nukleotida ciri-cirinya, anda pasti berurusan dengan gen-gen prokariote. (Untuk menjadi sangat tepat, gen 16S RNA di sana dan di eukariot, tetapi tidak di dalam kromosom nuklear dan mitokondria Ini sekali lagi mengesahkan bahawa mitokondria -. Keturunan Distant bakteria simbiotik organisma eukariot dahulu.)

Gen ini mempunyai kedua-dua kawasan konservatif, sama untuk semua prokariot, dan spesies spesifik. Tapak konservatif berfungsi untuk peringkat pertama tindak balas rantai polimerase - melampirkan DNA ujian ke primer (tapak benih DNA yang mana rantaian nukleotida yang dikaji mesti bergabung untuk memulakan menganalisis sisa urutan), dan spesies spesifik - untuk menentukan spesies. Di samping itu, tahap keserupaan spesies spesies spesifik mencerminkan persaudaraan evolusi spesies yang berlainan.

Bonus tambahan ialah untuk pengklonan dan analisa berikutnya, anda boleh menggunakan RNA ribosom sendiri, yang terdapat dalam mana-mana sel dalam kuantiti yang jauh lebih besar daripada gennya yang sepadan. Hanya anda mesti terlebih dahulu "menulis semula" ia dalam DNA menggunakan enzim khas - transkripase terbalik.

Susunan nukleotida RNA 16S bagi semua bakteria dan arkea yang diketahui (kira-kira 10,000 spesies) boleh didapati secara meluas. Urutan yang dikenal pasti dibandingkan dengan mereka dalam pangkalan data dan mengenal pasti jenis bakteria dengan tepat atau mengisytiharkan ia menjadi kepunyaan spesies yang tidak diternak.

Baru-baru ini terdapat semakan intensif terhadap lama, fenotip, klasifikasi bakteria, berdasarkan kriteria yang tidak formal - dari penampilan koloni ke pilihan makanan dan keupayaan untuk bernoda dengan pelbagai pewarna. Sistematik baru berdasarkan kriteria molekul (RNA 16S) dan hanya sebahagiannya mengulangi fenotip.

Urutan pengekodan 16S RNA oleh PCR telah pulih secara langsung dari "alam sekitar" - 125 miligram manusia, maaf, najis, telah dimasukkan ke dalam plasmid E. coli (bukan kerana ia usus, dan kerana Escherichia coli - salah satu kuda beban kegemaran ahli biologi molekul ) dan sekali lagi terpencil dari budaya bakteria yang disebarkan. Oleh itu, pustaka gen 16S semua mikroorganisma dalam sampel dicipta. Selepas itu, 284 klon dipilih secara rawak dan dijujukan. Ternyata hanya 24% daripada urutan RNA 16S yang diperolehi daripada mikroorganisme yang diketahui sebelumnya. Tiga perempat daripada mikroflora dalam usus setiap orang selama lebih dari seratus tahun menghindari perhatian para penyelidik bersenjata dengan kaedah mikrobiologi klasik! Para saintis semata-mata tidak dapat mencari syarat untuk penanaman bakteria ini, kerana penghuni usus yang paling tidak beralasan menolak untuk berkembang pada media mikrobiologi tradisional.

Hari ini, menggunakan kaedah molekul, telah ditubuhkan bahawa 10 daripada 70 taksonomi bakteria besar diwakili dalam mikrobiota dewasa. Kira-kira 90% daripada mikrob kami tergolong dalam jenis Firmicutes (ini termasuk, sebagai contoh, lactobacilli yang terkenal - utama "pesalah" susu souring) dan Bacteroidetes - mewajibkan anaerobes (organisma yang boleh hidup hanya dalam ketiadaan oksigen), yang sering digunakan sebagai penunjuk pencemaran kumbahan perairan semulajadi. Baki 10% daripada penduduk dibahagikan antara taxa Proteobacteria (ini termasuk, antara lain, E. coli), Actinobacteria (dari salah satu daripada spesies Actinomycetes streptomycin antibiotik telah diasingkan), Fusobacteria (penduduk normal rongga mulut dan sering menyebabkan periodontitis), Verrucomicrobia (baru-baru ini sumber panas bumi didapati spesies mikrob ini yang memakan metana, yang banyak terdapat di dalam usus kerana aktiviti penting mikroorganisme lain), Cyanobacteria (mereka masih sering disebut nama lama "alga biru-hijau"), Spirochaeates ( Tew, tidak pucat), Synergistes dan VadinBE97 (apa jenis haiwan ini, minta pencipta sistematik prokariotik baru).

Walaupun komposisi spesies mikroorganisma usus agak membosankan, nisbah kuantitatif wakil dari beberapa kumpulan sistematik dalam mikrobiota orang yang berbeza boleh berbeza-beza. Tetapi apakah mikroflora usus normal dan apakah cara pembentukannya?

Persoalan ini dijawab dalam kerja tahun 2007 oleh sekumpulan ahli biologi Amerika yang diketuai oleh Patrick Brown dari Stanford University. Mereka mengesan pembentukan microbiota dalam 14 bayi yang baru dilahirkan semasa tahun pertama kehidupan. Penulis dapat menubuhkan beberapa sumber penjajahan saluran pencernaan. Mikrobiota bayi mempunyai persamaan dengan mikroflora ibu: vagina, fecal atau mikroflora sampel susu ibu. Bergantung pada sumber penjajahan, spesies yang berlainan berlaku dalam mikroflora usus bayi pada tahun pertama kehidupan. Perbezaan ini kekal signifikan sepanjang keseluruhan tempoh kajian, tetapi pada usia satu tahun, pembentukan mikrobiota dewasa menjadi nyata. Data menarik diperoleh daripada contoh sepasang kembar. Mikrofora di dalamnya hampir sama dalam komposisi dan berubah dengan cara yang sama juga. Keputusan ini mendedahkan peranan besar komponen manusia dari pasangan microbiota-host dalam pembentukan populasi mikroflora usus. Untuk kemurnian eksperimen, tentu saja, perlu untuk memisahkan bayi semasa masih di hospital - cerita hebat untuk filem India! Selama bertahun-tahun, mereka dapat mengenal satu sama lain dengan analisis... Tetapi data dari kerja lain mengesahkan anggapan bahawa individu, termasuk keturunan, ciri-ciri biokimia manusia mempunyai pengaruh yang besar terhadap komposisi mikrobiotanya.

Mikrob dalam diri kita lebih daripada manusia

Selain mengkaji beberapa jenis mikroflora usus, beberapa tahun kebelakangan ini, banyak penyelidik telah mempelajari metagen bakteria - satu set gen semua mikroorganisma dalam sampel kandungan usus manusia (sama ada dibasuh dari kulit, atau dalam contoh lumpur dari dasar laut). Untuk tujuan ini, yang paling automatik, berkomputer dan berprestasi tinggi teknologi penjujukan DNA, yang membolehkan untuk menganalisis urutan nukleotida version, mengumpul teka-teki beberapa kebetulan "surat" di hujung bahagian ini, pelbagai ulang prosedur ini untuk setiap bahagian genom dan menerima penyahkodan gen individu dan kromosom pada kadar yang sehingga 14 juta nukleotida per jam - pesanan magnitud lebih cepat daripada ini dilakukan hanya beberapa tahun yang lalu. Jadi, didapati bahawa mikrobiota usus manusia mempunyai kira-kira 100 trilion sel bakteria - kira-kira 10 kali lebih banyak daripada jumlah sel dalam badan tuan rumah. Set gen yang membentuk metagenoma bakteria adalah kira-kira 100 kali lebih besar daripada set gen badan manusia. Jika kita bercakap tentang jumlah tindak balas biokimia yang berlaku di dalam populasi mikrob, ia sekali lagi berkali-kali lebih tinggi daripada itu di dalam tubuh manusia. "Reaktor bakteria" menerapkan rantaian metabolik dalam organisma tuan rumah bahawa ia tidak dapat menyokong dirinya sendiri - sebagai contoh, sintesis vitamin dan prekursor mereka, penguraian racun tertentu, penguraian selulosa kepada polysaccharides dicerna (ruminansia), dan sebagainya.

Kajian yang dijalankan di makmal Jeffrey Gordon (Sekolah Perubatan di University of Washington, St. Louis, Missouri) dibenarkan mengaitkan kepelbagaian spesies bakteria saluran gastrousus dengan ciri diet dan metabolik individu. Hasil eksperimen itu diterbitkan dalam isu Alam Disember 2006. Eksperimen satu tahun mencadangkan mewujudkan hubungan antara berat badan yang berlebihan pada manusia dan komposisi populasi mikrob ususnya. Selusin orang lemak yang bersetuju untuk meletakkan perut mereka di mezbah sains, dibahagikan kepada dua kumpulan. Satu pergi ke diet rendah lemak, yang lain diet rendah karbohidrat. Kesemua sukarelawan kehilangan berat badan, dan pada masa yang sama mereka mengubah nisbah dua kumpulan utama mikroorganisma usus: jumlah sel Firmicutes menurun, dan jumlah Bacteroidetes, sebaliknya, berkembang. Pada diet rendah lemak, perubahan seperti ini menjadi lebih teruk kemudian - selepas pesakit kehilangan 6% berat badan mereka, dan diet rendah karbohidrat - selepas kehilangan kilogram pertama (2% berat badan awal mereka). Dalam kes ini, perubahan dalam komposisi mikroflora adalah lebih ketara, semakin kurang berat peserta dalam eksperimen menjadi.

Secara selari, di makmal yang sama, eksperimen dilakukan pada tikus makmal yang membawa mutasi dalam gen untuk leptin, "hormon kenyang", protein yang disintesis dalam sel-sel tisu adipose dan menyumbang kepada pembentukan rasa kenyang. Tikus yang merosakkan kedua-dua salinan gen ini (mutasi ini ditunjukkan oleh indeks Lep ob), makan 70% lebih banyak daripada jenis liar, dengan semua akibat yang berikutnya. Dan kandungan Firmicutes dalam usus mereka adalah satu setengah kali lebih tinggi daripada garis heterozigot, dengan hanya satu alel yang cacat (ob / +), dan homozigot untuk gen normal jenis liar-jenis (+ / +).

Pengaruh mikroflora pada metabolisme "pemiliknya", penyelidik memeriksa model lain - tikus gnotobioticheskimi.

Haiwan sedemikian, yang dari saat kelahiran tinggal di dalam bilik steril dan tidak pernah bertemu dengan mikrob tunggal dalam kehidupan mereka, tidak sering digunakan dalam penyelidikan bioperubatan. Kemandulan mutlak dalam otot, arnab, dan terutamanya kandang kambing - adalah mahal dan menyusahkan, dan selepas bertemu dengan mikrob atau virus pertama, makhluk-makhluk yang miskin akan mati atau tidak sesuai untuk eksperimen selanjutnya. Apa yang berlaku di gnotobiotov dengan sistem kekebalan tubuh adalah cerita yang berasingan, dan mereka makan selama tiga dan pada masa yang sama - kulit dan tulang kerana kurangnya komponen mikroba penghadaman.

Selepas pemindahan mikroflora dari penderma obes (ob / ob), tetikus gnatobiot dalam dua minggu menebal hampir satu setengah kali (47%). Mereka yang "biji" dengan mikroflora dari penderma jenis-jenis liar (+ / +) dengan berat normal, hanya mendapat 27%.

Hasil kajian lanjut tentang perubahan dalam organisma tikus-mikroba simbiotik dengan cemerlang mengesahkan hipotesis bahawa mikrobiota individu gemuk menyumbang kepada pemprosesan makanan yang lebih dalam. Perbandingan sampel DNA tinja dari tikus yang obes dan normal telah menunjukkan bahawa mikrobiom obesiti tepu dengan gen enzim yang membolehkan lebih banyak kemerosotan polisakarida. Usus tikus lemak mengandung sejumlah besar produk akhir penapaian - sebatian asetik dan butirat asam, yang menunjukkan pemprosesan lebih dalam komponen makanan. Calorimetrik (dari perkataan "kalori"!) Analisis sampel najis mengesahkan ini: najis tikus ob / ob mengandungi kalori yang lebih sedikit daripada tikus jenis liar, yang tidak sepenuhnya menyerap tenaga dari makanan.

Sebagai tambahan kepada maklumat penting mengenai komponen mikroba "obesitas", penulis dapat menunjukkan persamaan asas mikroflora pada orang gemuk dan tikus, yang membuka perspektif baru dalam mengkaji masalah berat badan berlebihan, dan mungkin menyelesaikan masalah ini dengan "memindahkan" mikroflora yang sihat atau pembentukannya pada pesakit obes.

Hakikat bahawa mikrobiota dapat mengawal metabolisme tuan rumah tidak lagi diragukan. Penyelidikan Gordon mengenai berat badan berlebihan telah membenarkan jambatan untuk merawat penyakit metabolik, seperti keletihan umum yang memberi kesan kepada kanak-kanak dari satu hingga empat tahun di negara-negara miskin dengan iklim tropika - marasmus (kata ini hanya mempunyai hubungan linguistik dengan marasmus: marasmus Yunani secara harfiah bermakna keletihan, kepupusan) dan kwashiorkor (dalam bahasa salah satu suku kaum Ghana, kwashiorkor - "budak merah"). Kemunculan penyakit dikaitkan dengan kekurangan protein dan vitamin semasa peralihan dari penyusuan kepada makanan dewasa. Tetapi penyakit itu secara terpengaruh memberi kesan kepada anak-anak yang saudara lelakinya tidak mengalami sebarang masalah dengan peralihan kepada diet tradisional untuk rantau ini. Kajian telah menunjukkan bahawa mikroflora usus kanak-kanak yang sakit sangat berbeza dengan mikroflora ibu bapa mereka, dan juga dari mikroflora saudara lelaki yang sihat. Pertama sekali, terdapat ketiadaan hampir di dalam populasi usus Bacteroidetes dan dominasi spesies langka yang dipunyai oleh jenis Proteobacteria dan Fusobacteria. Selepas kanak-kanak yang sakit (dengan berhati-hati, supaya tidak berlebihan!) Makan makanan secara intensif-protein, mikrobiota mereka sama seperti biasa, seperti saudara-mara, dengan kekayaan Bacteroidetes dan Firmicutes.

Kajian baru-baru ini tidak hanya mengubah pemahaman semasa mikroflora usus manusia, tetapi juga menyumbang kepada kemunculan konsep yang menganggap mikrobiota usus sebagai organ organ multiselular tambahan tubuh manusia. Sebuah organ terdiri daripada pelbagai garis sel yang mampu berkomunikasi antara mereka dengan organisme tuan rumah. Badan yang mengedarkan semula arus tenaga, melakukan tindak balas fisiologi yang penting, perubahan di bawah pengaruh alam sekitar dan regenerasi diri apabila perubahan disebabkan oleh keadaan luaran.

Meneruskan kajian "organ bakteria" boleh dan harus membawa kepada pemahaman tentang undang-undang fungsinya, pendedahan hubungannya yang halus dengan organisme tuan rumah dan, sebagai hasilnya, kemunculan kaedah baru memerangi penyakit manusia melalui rawatan sasaran disfungsi kedua-dua komponen metaorganisme.

Valery Poroiko, Ph.D.
Universiti Chicago, Jabatan Pembedahan Am
Portal "Pemuda Kekal" www.vechnayamolodost.ru

Versi jurnal artikel yang disiarkan dalam Mekanik Popular No. 4-2008

Pengenalpastian spesies bakteria dengan menjejaki gen 16S RNA ribosom, peranan dan tempat kaedah dalam diagnosis jangkitan bakteria. Selesai: Saveliev. - persembahan

Persembahan itu diterbitkan 4 tahun yang lalu oleh Ludmila Shumikhina

Penyampaian yang berkaitan

Pembentangan kelas ke-11 mengenai topik: "Pengenalpastian spesies bakteria dengan menjejaki gen 16S RNA ribosom, peranan dan tempat kaedah dalam diagnosis jangkitan bakteria. Selesai: Saveliev.". Muat turun secara percuma dan tanpa pendaftaran. - Transkrip:

1 Pengenalpastian spesies bakteria dengan menjejaki gen 16S RNA ribosom, peranan dan tempat kaedah dalam diagnosis jangkitan bakteria : Cand. biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich PhD biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 Tugas: 1. Menguasai kaedah elektroforesis DNA dalam gel agarose 2. Menguasai kaedah menganalisis hasil penjujukan dan untuk membina urutan nukleotida serpihan gen 16 S RNA ribosomal dari isolat Bacillus genus yang mengasingkan 1. Menguasai kaedah elektroforesis DNA dalam gel agarose 2. Menguasai kaedah menganalisis hasil penjujukan dan menjalankan pembinaan urutan nukleotida serpihan 16 S gen RNA ribosom yang diperoleh dari isolat genus Bacillus 3. Meneliti prospek untuk penggunaan bersama kaedah penjujukan dan biokimia pengenalpastian bakteria 3. Untuk mengkaji prospek untuk berkongsi kaedah penjujukan dan pengenalan bakteria biokimia Objektif: Untuk mengkaji kemungkinan kaedah mengenal pasti bakteria spesifik menggunakan kaedah penjujukan gen 16S RNA ribosom dalam gabungan dengan kaedah pengenalan tradisional.

3 bahan-bahan dan kaedah-kaedah Kaedah pemurnian budaya tulen telah ditaburi di MPA dan, selepas jam pengeraman, penggantungan bakteria telah disediakan pada buffer fosfat-saline. Budaya telah diwarnai oleh Gram dan mikroskopik. Dinilai mengikut sifat biokimia: Pelupusan sitrat, malonate, glukosa, laktosa, mannitol, sukrosa, inositol, sorbitol, arabinose, maltosa, phenylalanine, pembentukan indole, hidrogen sulfida, atsetilmetilkarabinola (Reaction Foges- Proskauer), kehadiran beta-galactosidase, urease, decarboxylase arginine dan lisin, arginine hydrolase. Budaya telah diuji untuk aktiviti catalase, cytochrome oxidase, pembentukan nitrit, sintesis pigmen, rintangan antibiotik, mengkaji sifat-sifat budaya dan morfologi. Beta-galactosidase, dan tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktiviti telah diuji ke atas medium Uriselekt 4 (BioRad) DNA telah diasingkan oleh pandangan fenolhloroformennym ditentukan berdasarkan aturan 16S gen ribosom daripada RNAi serpihan spacer intergenic RNA ribosom dan 16-23S kemajmukan biokimia, budaya dan morfologi ciri-ciri.

4 Ciri-ciri kebudayaan: budaya dewasa tidak berkembang pada medium Endo, iaitu. tidak termasuk dalam enterobacteria, tumbuh pada agar-peptone daging dan di bawah keadaan aerobik pada 37 ° C Ciri-ciri Tactorial: tumbuh dewasa dikaji secara mikroskopik dan berwarna Gram, yang dibenarkan untuk menentukan bahawa budaya yang diperoleh tergolong dalam membentuk Gr & rods Ciri-ciri budaya

Reka bentuk kajian: DNA telah diasingkan daripada budaya yang tumbuh dan PCR ditubuhkan dengan primer sejagat; sebagai hasilnya, kita menguatkan satu fragmen gen 16S RNA ribosom

6 Larutan dengan primer diedarkan dalam 4 tiub ujian, masing-masing mengandungi 4 deoxynucleotides dATP, dTid, dTPP (salah satunya ditandai dengan isotop radioaktif) dan satu daripada empat 2; ia diaktifkan dalam semua kedudukan campuran rantaian yang semakin meningkat, dan selepas lampirannya, pertumbuhan rantaian segera berhenti. Akibatnya, dalam setiap empat tiub, dengan penyertaan polimerase DNA, satu set unik oligonukleotida yang berbeza panjang terbentuk, termasuk urutan primer. Seterusnya, secara automatik ditambah ke tiub untuk mengalihkan rantai dan elektroforesis gel polyacrylate dilakukan pada empat lorong. Radioautografi dijalankan, yang membolehkan anda "membaca" urutan nukleus segmen DNA untuk dijujukan. Dalam biokimia dan biologi molekul, elektroforesis digunakan untuk memisahkan makromolekul protein dan asid nukleik (serta serpihannya). Terdapat banyak jenis kaedah ini. Kaedah ini menemui aplikasi terluas untuk pemisahan campuran biomolekul ke dalam pecahan atau bahan-bahan individu dan digunakan dalam biokimia, biologi molekul, diagnostik klinikal, biologi populasi (untuk mengkaji variabilitas genetik), dan lain-lain asid nukleat protein. penyelesaian) dalam medium cecair atau gas di bawah tindakan medan elektrik luaran. Fenomena elektrokinetik elektroforesis medan elektrik Reka bentuk kajian: Produk PCR dipisahkan oleh elektroforesis gel agarosa. Kaedah Sanger

7 Hasil penyelidikan kita sendiri Rajah 1 Hasil elektroforesis kapilari serpihan 16 S gen RNA ribosom

8 Rajah 2 pokok phylogenetic yang dibina berdasarkan hasil penyelarasan fragmen gen 16S RNA ribosom

9 Keputusan penyelidikan sendiri Pic. 3 Keputusan perbandingan urutan nukleotida

10 Keputusan kajian biokimia budaya menggunakan ujian PBDE sifat biokimia terikan B.licheniformis: penggunaan sitrat negatif, malonate negatif, natrium sitrat + glukosa lysine negatif negatif, arginine negatif, ornithine negatif, phenylalanine negatif, indole negatif, urease atsetilmetilkarabinol positif negatif sulfida negatif, glukosa positif, b-galactosidase positif, negatif laktosa, positif, sukrosa positif, inositol positif oh, sorbitol adalah positif, maltosa adalah positif

11 Kesimpulan Pengenalpastian spesifik mikroorganisma berdasarkan penjujukan boleh menjadi "standard emas" diagnostik makmal, bagaimanapun, ketepatan kaedah ini terhad oleh ketepatan dan kelengkapan pangkalan data GenBank dan, oleh itu, memerlukan penggunaan tambahan ujian pengesahan.

16s analisis rna

Bioteknologi, 2005, №6, ms 3-11

Kaedah untuk mengenal pasti mikroorganisma berdasarkan analisis polimorfisme panjang serpihan sekatan (PDFR) produk PCR gen RNA 16S dengan panjang 1500 nukleotida dicadangkan. Satu set 6 endonucleases sekatan (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI, dan RsaI) dipilih, yang membolehkan pengenalpastian pelbagai mikroorganisma menggunakan PCGF.
Empat isolat fosfatase alkali termolabile telah diasingkan daripada penulenan air laut semula jadi. Analisis PDFR untuk strain ini berbanding dengan hasil yang dikira yang diperoleh untuk gen RNA 16S pelbagai mikroorganisma, memungkinkan untuk menentukan bahawa pengeluar yang dikenal pasti tergolong dalam genus Alteromonas.

Bersama dengan kaedah tradisional untuk mengenal pasti mikroorganisma menggunakan ciri-ciri budaya dan morfologi, serta tindak balas kimia dan biokimia, kaedah untuk menentukan mikroorganisma berdasarkan perbandingan urutan nukleotida pelbagai gen mikroorganisma [2-4] dan analisis polimorfisme panjang serpihan sekatan DNA diperoleh hasil daripada penguatan gen bakteria individu [5, 6]. Gen pengekodan 16S dan 23S ribosom RNA adalah yang paling sesuai untuk pengenalpastian, kerana ia hadir dalam semua sel bakteria dan spesifik genus untuk kebanyakan mikroorganisma [7-9]. Penggunaan fragmen DNA yang mengandungi kedua-dua gen RNA 16S dan 23S dan spacer di antara mereka, yang lebih berubah-ubah, boleh digunakan untuk mengenalpasti spesies dan subspesies yang berkaitan dengan mikroorganisma [10].

Makalah ini membentangkan hasil analisis FDPR dari produk PCR 1500 nukleotida panjang untuk pelbagai mikroorganisma dan ditunjukkan bahawa penggunaan 6 endonucleases pembatasan Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI dan RIAI membolehkan untuk mengenal pasti majoriti mikroorganisma. Dalam karya ini, 4 pengeluar baru phosphatase alkali termolabile telah dikenalpasti dan menggunakan kaedah yang dicadangkan, analisis perbandingan PDPR dilakukan untuk mengenal pasti mikroorganisma ini. Berdasarkan perbandingan, disimpulkan bahawa pengeluar yang ditemui tergolong dalam genus Alteromonas.

SYARAT-SYARAT KHAS

Untuk mengenal pasti pengeluar fosfatase alkali termolabile, 50 μl air laut adalah permukaan permukaan nutrien dan dianalisis seperti yang dijelaskan dalam [11]. Pengeluaran biomassa mikroorganisma dilakukan dengan menumbuhkan pengeluar pada suhu 20 ° C dalam kaldu yang mengandungi tryptone 1% (AGS GmbH, Jerman), 0.5% ekstrak yis (syarikat yang sama) dan air garam (NaCl - 27.5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0.5, KCl - 1, FeSO4 - 0.001 g / l [12]), pH 7.2 - 7.7. Sapi dibudidayakan dalam 200 ml dalam 700 ml flush kerusi goyang dan digoncang pada 150 rpm selama 16 h.

Pengasingan DNA kromosom dilakukan mengikut kaedah [13].

Pengukuhan gen 16S RNA ribosom dilakukan menggunakan reaksi rantai polimerase seperti yang dijelaskan dalam [14].

Reaksi sekatan DNA diperkuat dilakukan selama 4 jam pada 37 ° C dalam 20 μl campuran reaksi yang mengandungi 2 unit. bertindak menyekat Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI atau RsaI yang dihasilkan oleh NPO SibEnzyme, dalam penampan yang sepadan. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 5 μl larutan stop yang mengandungi 0.1 M EDTA, 0.05% bromofenol biru dan 40% sukrosa.

Pemisahan elektroforetik produk sekatan DNA yang diperkuatkan dilakukan dalam 2% agarose (Sigma) dalam penyangga tris-asetat dengan etidium bromida (0.5 mg / l) pada 120 V selama 4 jam.

Untuk menentukan panjang serpihan DNA, penanda berat molekul DNA digunakan (100bp +1.5 Kb penanda DNA, NPO SibEnzyme). Penentuan panjang batasan yang diperoleh dilakukan menggunakan program komputer Gel Pro Analyzer, versi 4.0.00.001. Identiti peratus panjang potongan dikira untuk setiap pasangan mikroorganisma, membandingkan corak sekatan secara berasingan untuk setiap enzim sekatan. Apabila membandingkan panjang sekatan, serpihan DNA dianggap sama, panjang yang berbeza tidak melebihi 5%.

Untuk membandingkan data eksperimen dengan urutan gen RNA 16S yang diterbitkan, bank data genetik urutan yang dijujukan digunakan.

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

Dari isolat semula jadi air laut, kami mengasingkan empat penunjuk strain termolabile phosphatase, yang ditetapkan sebagai 20, 27, 48 dan strain yang dijelaskan sebelum ini [11] menggunakan kaedah tradisional sebagai Alteromonas undina. Untuk mengenal pasti strain yang diperolehi daripada biomas mikroorganisma yang ditanam dalam medium nutrien cecair dengan penambahan garam laut, DNA kromosom telah diasingkan.
Selanjutnya, DNA kromosom digunakan dalam reaksi rantai polimerase untuk menguatkan gen 16S RNA ribosom. Produk amplifikasi dirawat secara berasingan dengan 6 endonucleases sekatan yang berbeza. Semua sekatan yang digunakan oleh kami mempunyai tapak pengiktirafan tetranucleotide, yang memungkinkan untuk mendapatkan dari 3 hingga 8 serpihan DNA akibat pembengkakan produk penguatan, yang mempunyai panjang 1500 nukleotida. Enzim sekatan Sse9I dan Tru9I yang digunakan, masing-masing, tapak pengiktirafan AATT dan TTAA, manakala enzim sekatan BsuRI dan MspI dipotong melalui tapak GGCC dan CCGG. Laman web sekatan BstMBI dan RsaI, masing-masing GATC dan GTAC, mengandungi empat nukleotida. Pemilihan endonucleases sekatan itu, menurut pendapat kami, harus memberikan kesedaran dalam mengenal pasti mikroorganisma dengan kedua-dua gen yang kaya dengan AT dan kaya GC. Dalam segi kuantitatif, kita mempertimbangkan penggunaan 6 enzim sekatan yang berbeza untuk optimum, kerana penggunaan 1 atau 3 mengehadkan, seperti yang dicadangkan dalam beberapa kertas [10,15], mungkin tidak mendedahkan polimorfisme dalam mengenal pasti mikroorganisma yang berkait rapat atau, sebaliknya, membawa kepada perbezaan terlalu besar dari untuk satu atau lebih mutasi rawak. Pada masa yang sama, penggunaan 10 endonucleases sekatan yang berbeza tidak membawa kepada pengenalan tambahan terhadap panjang pecahan polimorfisme DNA dan jelas berlebihan [9].
Rajah 1 menunjukkan corak simulasi komputer bagi sekatan 16S gen untuk RNA, satu set enam enzim sekatan yang dicadangkan oleh kami (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI dan RsaI). 16S RNA gen diambil dari bank genetik urutan urutan. Pilihan mikroorganisma agak rawak. Semua bakteria tergolong dalam genera yang berbeza dan mewakili kedua-dua mikroorganisma gram-negatif dan gram-positif. Ia dilihat bahawa bagi semua mikroorganisma mempunyai corak tersendiri set set. Bilangan serpihan DNA berbeza-beza dari 23 hingga 30 (serpihan panjang kurang daripada 100 pasangan asas tidak diambil kira). Keputusan pengiraan identiti peratus daripada panjang serpihan DNA (sekatan serpihan panjang serupa dianggap berbeza tidak lebih daripada 5%) untuk pasangan yang berbeza mikroorganisma yang ditunjukkan dalam Jadual 1. Jadual ini menunjukkan hanya sebahagian daripada pasangan mungkin mikroorganisma yang ditunjukkan dalam Rajah. 1. Tetapi hasil perbandingan yang dibentangkan agak bersifat khas dan membolehkan kita melihat bahawa identiti peratus panjang serpihan DNA biasanya berkisar dari 12-28% untuk wakil-wakil genera yang berbeza dari mikroorganisma. Oleh itu, data yang dikemukakan menunjukkan bahawa corak sekatan 16S RNA gen dengan set enzim sekatan yang ditawarkan oleh kami boleh menjadi asas untuk mengenal pasti genus sel bakteria.

Rajah. 1. corak Secara teorinya dikira pemisahan elektroforetik 16S RNA produk gen penguatan selepas rawatan dengan sekatan enzim Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) dan RsaI (6). Jejak M - penanda berat molekul

Nilai RNA 16S dalam sistematik. Hibridisasi molekul 16S RNA.

Hibridisasi molekul 16S rRNA. Ribosom prokariotik terdiri daripada 3 subunit, besar (23S), (5S) dan (16S). Gen 16S RRNA mempunyai ciri-ciri berikut yang penting dalam filogeni:

1. Ribosom RNA adalah universal untuk spesies yang berbeza, seperti ribosomes sendiri. 2. RRNA molekul 16S adalah konservatif dan paling tidak terdedah kepada perubahan dalam perjalanan evolusi biologi. Kadar perubahan gen rRNA 16S dalam pelbagai bakteria simbiotik ialah 2-4% penggantian nukleotida lebih dari 60 Myr.3. Gen rRNA 16S mempunyai kedua-dua wilayah (domain) ultraconserved dan berubah-ubah, yang memungkinkan untuk menilai hubungan kekeluargaan yang jauh dan dekat.4. Di samping itu, didapati bahawa cistron rRNA tidak terlibat dalam proses pemindahan genetik interspesif.5. Saiz gen (dalam prokariote, kira-kira 1550-1640 bp panjang) adalah optimum dari sudut pandangan mengurangkan ralat statistik. Urutan lengkap boleh ditentukan dalam satu jujukan dengan menggunakan kaedah Sanger. Perbandingan direktori nukleotida. Kaedah ini digunakan pada tahun 80-an dan mempunyai kepentingan sejarah yang besar dalam sistematik bakteria. Pada masa yang sama, molekul RNA (16S rRNA) dirawat dengan ribonuclease T, yang memecahkan molekul ke dalam residu guanine. Saiz serpihan yang diperoleh tidak melebihi 20 nukleotida. Oligonukleotida yang dihasilkan telah dipisahkan oleh elektroforesis 2 dimensi, disusun, dan disusun suatu katalog yang khusus mencirikan molekul rRNA. Apabila membandingkan katalog, serpihan dengan sekurang-kurangnya 6 nukleotida diambil kira. Dengan menggunakan koefisien persamaan antara katalog, pokok phylogenetic untuk prokariot pertama dibina. Ribofrinting. Kaedah ini berdasarkan analisis sekatan gen rRNA. Untuk ini, jumlah DNA diasingkan dari sel. Dua primolog homolog ke kawasan pergunungan yang sangat konservatif dari 16S rRNA (subunit kecil - ss rDNA) diambil dan PCR dilakukan. Serpihan itu diproses dengan beberapa endonucleases sekatan, dan produk sekatan untuk setiap endonukleases dipisahkan pada gel agarose bersama dengan profil saiz DNA standard. Polimorfisme panjang fragmen berlaku kerana fakta bahawa sebahagian daripada laman sekatan jatuh ke dalam domain konservatif gen, dan beberapa - menjadi domain berubah. Dalam bahagian ini serpihan akan menjadi biasa kepada semua spesies dalam sampel. Dengan bilangan serpihan biasa dan berbeza, adalah mungkin untuk mengira jarak genetik antara spesis. Penggunaan 12 enzim sekatan dengan laman pengiktirafan daripada 4 nukleotida panjang menjadikannya mungkin untuk menampung 10-15% panjang gen rRNA 16S dengan analisis tanpa penjujukan.

Dear Microbe

Valery Poroiko,
Ph.D., University of Chicago, Jabatan Pembedahan Am
Mekanik Popular ı4, 2008

Hanya seratus tahun yang lalu, mikrob yang hidup di usus manusia dianggap parasit dan perosak. Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, microbiota manusia telah dipanggil sejenis organ badan kita, yang diperlukan untuk berfungsi normal badan.

Sejak zaman Pasteur, diketahui bahawa saluran gastrointestinal manusia pada dasarnya adalah bioreaktor jenis aliran, di mana banyak mikroorganisma mendiami. Sikap saintis ke mikroflora usus pada masa ini telah berubah secara radikal. Seratus tahun yang lalu, Ilya Mechnikov yang terkenal, pengasas teori kekebalan moden, untuk penciptaan yang dia terima Hadiah Nobel (untuk dua dengan lawannya yang tidak dapat dipertanggungjawabkan, Paul Ehrlich yang kurang hebatnya), bahkan menawarkan untuk mengeluarkan usus besar sebagai salah satu cara untuk memanjangkan hayat. Dan bagi mereka yang ukuran ini kelihatannya terlalu radikal, saya mengesyorkan untuk meminum sebanyak mungkin kefir untuk menindas berbahaya, pada pendapatnya, mikrob yang mempunyai bakteria asid laktik yang bermanfaat. Selepas setengah abad, kursus ini telah berubah sebanyak 180 darjah. Ternyata mikroflora usus normal, serta kulit dan membran mukus, melakukan banyak fungsi berguna - sebagai contoh, ia menekan aktiviti penting mikroorganisma patogen yang sentiasa menyerang tubuh. Dan dalam beberapa tahun kebelakangan ini, ahli mikrobiologi yang paling berani telah pergi jauh, mengisytiharkan lelaki dan mikroba sebagai satu superorganisme simbiotik tunggal.

Pengembangan kaedah biologi molekul membawa saintis ke tahap pemahaman yang baru mengenai proses-proses simbiosis manusia dan mikrofloranya, yang seolah-olah dipelajari dengan baik dan tidak mengharapkan sebarang kejutan khusus dari kajian lanjut. Pertumbuhan pesat dalam kelajuan dan kejatuhan kos kaedah penjujukan DNA (menentukan urutan nukleotida) dan peningkatan selari dalam kuasa komputer peribadi dan pembangunan Internet memungkinkan untuk menganalisis maklumat mengenai kawasan genom yang besar. Selepas kromosom beratus-ratus spesies bakteria individu telah diuraikan, pendekatan baru telah muncul dalam genetik mikroorganisma - berasaskan populasi: menganalisis gen semua bakteria kawasan tertentu sekaligus. Sudah tentu, populasi "bioreaktor manusia" ternyata menjadi salah satu yang paling penting bagi kajian populasi mikrob.

Kerja pertama, yang membawa kepada pandangan yang baru pada mikrobiota usus, diterbitkan pada tahun 1999 oleh sekumpulan saintis dari Institut Penyelidikan Agronomi Nasional (Perancis) dan Universiti Reading (Great Britain). Penulis memutuskan untuk menerapkan cara mengurusi 16S RNA gen untuk mengkaji populasi mikrob pada usus (lihat sidebar).

16S PHK - ID bakteria

Langkah pertama dalam penentuan mikroorganisma ialah penanaman mereka terhadap media nutrien. Tetapi beberapa mikrob tidak mahu berkembang dalam mana-mana medium.

Teknik moden
Kajian sebelum ini tidak boleh diakses bakteria bukan culturable dan mula mengenakan perintah sama sekali mengelirukan taksonomi prokariot sudah diketahui menjadi mungkin dengan perkembangan bioinformatik dan kemunculan teknik-teknik moden biologi molekul - PCR membolehkan satu kawasan DNA untuk menerima berbilion replika, pengklonan gen yang dipilih dalam plasmid bakteria dan penjujukan urutan metodologi nukleotida diperolehi dalam jumlah yang mencukupi untuk dianalisis. Penanda yang ideal untuk mengenal pasti mikroorganisma ialah pengekodan gen 16S ribosom RNA (setiap satu daripada dua subunit bengkak sel ribosom untuk sintesis protein - terdiri daripada molekul protein tersambung dan rantai asid ribonukleik).

Penanda sempurna
Gen ini berada dalam genom semua bakteria dan arkea yang diketahui, tetapi ia tidak hadir dalam eukariota dan virus, dan jika anda mendapati urutan nukleotida ciri-cirinya, anda pasti berurusan dengan gen-gen prokariote. Gen ini mempunyai kedua-dua kawasan konservatif, sama untuk semua prokariot, dan spesies spesifik. Tapak konservatif berfungsi untuk peringkat pertama tindak balas rantai polimerase - melampirkan DNA ujian ke primer (tapak benih DNA yang mana rantaian nukleotida yang dikaji mesti bergabung untuk memulakan menganalisis sisa urutan), dan spesies spesifik - untuk menentukan spesies. Tahap keserupaan plot khusus spesies mencerminkan kekerabatan evolusi spesies yang berlainan. Untuk pengklonan dan analisis seterusnya, anda boleh menggunakan RNA ribosom itu sendiri, yang terdapat di mana-mana sel dalam kuantiti yang lebih besar daripada gen yang sepadan. Susunan nukleotida RNA 16S bagi semua bakteria dan arkea yang diketahui boleh didapati secara meluas. Urutan yang dikenal pasti dibandingkan dengan mereka dalam pangkalan data dan mengenal pasti jenis bakteria atau mengisytiharkan ia tergolong dalam spesis yang tidak ditanam.

Taksonomi baru
Baru-baru ini terdapat semakan intensif terhadap klasifikasi bakteria lama, phenotypic berdasarkan kriteria yang tidak formal - dari penampilan koloni ke pilihan makanan dan keupayaan untuk bernoda dengan pelbagai pewarna. Sistematik baru berdasarkan kriteria molekul (RNA 16S) dan hanya sebahagiannya mengulangi fenotip.

Apa yang kita ada di dalamnya

Susunan pengekodan 16S RNA diekstrak langsung dari "persekitaran" oleh 125 mg manusia melalui reaksi rantai polimerase (PCR), maaf, kotoran dimasukkan ke dalam plasmids Escherichia coli (bukan kerana usus, tetapi kerana Escherichia coli adalah salah satu kegemaran kerja keras ahli biologi molekul) dan sekali lagi terpencil dari budaya bakteria yang disebarkan. Oleh itu, pustaka gen 16S semua mikroorganisma dalam sampel dicipta. Selepas itu, 284 klon dipilih secara rawak dan dijujukan. Ternyata hanya 24% daripada urutan RNA 16S yang diperolehi daripada mikroorganisme yang diketahui sebelumnya. Tiga perempat daripada mikroflora dalam usus setiap orang selama lebih dari seratus tahun menghindari perhatian para penyelidik bersenjata dengan kaedah mikrobiologi klasik! Para saintis semata-mata tidak dapat mencari syarat untuk penanaman bakteria ini, kerana penghuni usus yang paling tidak beralasan menolak untuk berkembang pada media mikrobiologi tradisional.

Hari ini, menggunakan kaedah molekul, telah ditubuhkan bahawa 10 daripada 70 taksonomi bakteria besar diwakili dalam mikrobiota dewasa. Kira-kira 90% daripada mikrob kami tergolong dalam jenis Firmicutes (ini termasuk, sebagai contoh, lactobacilli yang terkenal - utama "pesalah" susu souring) dan Bacteroidetes - mewajibkan anaerobes (organisma yang boleh hidup hanya dalam ketiadaan oksigen), yang sering digunakan sebagai penunjuk pencemaran kumbahan perairan semulajadi. Baki 10% daripada penduduk dibahagikan antara taxa Proteobacteria (ini termasuk, antara lain, E. coli), Actinobacteria (dari salah satu daripada spesies Actinomycetes streptomycin antibiotik telah diasingkan), Fusobacteria (penduduk normal rongga mulut dan sering menyebabkan periodontitis), Verrucomicrobia (baru-baru ini sumber panas bumi didapati mempunyai bentuk mikrob ini yang memakan metana, yang banyak terdapat di dalam usus kerana aktiviti penting mikroorganisme lain), Cyanobacteria (mereka masih sering disebut "alga biru-hijau" hingga kini), Spirochaetes (nasib baik nd, tidak pucat), Synergistes dan VadinBE97 (apa jenis haiwan, minta pencipta taksonomi baru prokariot).

Mikrob dalam diri kita lebih daripada manusia

Untuk tujuan ini, teknologi penjujukan DNA yang paling automatik, berkomputer dan berprestasi tinggi digunakan, yang memungkinkan untuk menganalisis urutan nukleotida pendek, memasang teka-teki pada beberapa huruf yang sesuai di hujung bahagian ini, berulang kali mengulangi prosedur ini untuk setiap bahagian genom dan mendapatkan penyahkodan gen dan kromosom individu pada kelajuan sehingga 14 juta nukleotida per jam - pesanan magnitud lebih cepat daripada yang mereka lakukan beberapa tahun yang lalu. Jadi, didapati bahawa mikrobiota usus mempunyai kira-kira 100 trilion sel bakteria - kira-kira sepuluh kali lebih banyak daripada jumlah sel dalam tubuh manusia.

Set gen yang membentuk metagenoma bakteria adalah kira-kira seratus kali lebih besar daripada set gen badan manusia. Jika kita bercakap tentang jumlah tindak balas biokimia yang berlaku di dalam populasi mikrob, ia sekali lagi berkali-kali lebih tinggi daripada jumlah tindak balas biokimia dalam tubuh manusia.

Bakteria "reaktor" alat dalam rantaian tuan metabolik yang yang tidak mampu untuk menyokong dirinya - sebagai contoh, sintesis vitamin dan prekursor mereka, penguraian sebahagian toksin, penguraian selulosa untuk polisakarida hadam (ruminan), dan lain-lain...

Sejak kecil hingga tua

Walaupun komposisi spesies mikroorganisma usus agak membosankan, nisbah kuantitatif wakil dari beberapa kumpulan sistematik dalam mikrobiota orang yang berbeza boleh berbeza-beza. Tetapi apakah mikroflora usus normal dan apakah cara pembentukannya?

Persoalan ini dijawab dalam kerja tahun 2007 oleh sekumpulan ahli biologi Amerika yang diketuai oleh Patrick Brown dari Stanford University. Mereka mengesan pembentukan microbiota dalam 14 bayi yang baru dilahirkan semasa tahun pertama kehidupan. Penulis dapat menubuhkan beberapa sumber penjajahan saluran pencernaan. Mikrobiota bayi mempunyai persamaan dengan mikroflora ibu: vagina, fecal atau mikroflora sampel susu ibu. Bergantung pada sumber penjajahan, spesies yang berlainan berlaku dalam mikroflora usus bayi pada tahun pertama kehidupan. Perbezaan ini kekal signifikan sepanjang keseluruhan tempoh kajian, tetapi pada usia satu tahun, pembentukan mikrobiota dewasa menjadi nyata. Data menarik diperoleh daripada contoh sepasang kembar. Mikrofora di dalamnya hampir sama dalam komposisi dan berubah dengan cara yang sama juga. Keputusan ini mendedahkan peranan besar komponen manusia pasangan microbiota-host dalam pembentukan populasi mikroflora usus. Untuk kemurnian eksperimen, tentu saja, perlu untuk memisahkan bayi semasa masih di hospital (dengan cara itu, cerita yang indah untuk filem India! Selama bertahun-tahun, kembar mengenal satu sama lain dari analisis mikroflora.). Tetapi data dari kajian lain telah mengesahkan anggapan bahawa individu, termasuk keturunan, ciri-ciri biokimia manusia mempunyai pengaruh yang besar terhadap komposisi mikrobiotanya.

Nipis dan tebal

Kajian yang dijalankan di makmal Jeffrey Gordon (Sekolah Perubatan di University of Washington, St. Louis, Missouri), dibenarkan untuk mengaitkan kepelbagaian spesies bakteria saluran gastrointestinal dengan ciri diet dan metabolik individu. Hasil eksperimen itu diterbitkan dalam majalah Nature bulan Disember 2006. Eksperimen satu tahun mencadangkan mewujudkan hubungan antara berat badan yang berlebihan pada manusia dan komposisi populasi mikrob ususnya. Selusin orang lemak yang bersetuju untuk meletakkan perut mereka di mezbah sains, dibahagikan kepada dua kumpulan. Satu pergi ke diet rendah lemak, yang lain diet rendah karbohidrat. Kesemua sukarelawan kehilangan berat badan, dan pada masa yang sama mereka mengubah nisbah dua kumpulan utama mikroorganisma usus: jumlah sel Firmicutes menurun, dan jumlah Bacteroidetes, sebaliknya, berkembang. Pada diet rendah lemak, perubahan seperti ini menjadi lebih teruk kemudian - selepas pesakit kehilangan 6% berat badan mereka, dan diet rendah karbohidrat - selepas kehilangan kilogram pertama (2% berat badan awal mereka). Dalam kes ini, perubahan dalam komposisi mikroflora adalah lebih ketara, semakin kurang berat peserta dalam eksperimen menjadi.

Melawan obesiti

Hasil kajian lanjut oleh saintis perubahan organisma tikus-mikrobiologi simbiotik (lihat kotak "Diuji pada tikus") dengan cemerlang mengesahkan hipotesis bahawa mikrobiota individu gemuk menyumbang kepada pemprosesan makanan yang lebih dalam. Perbandingan sampel DNA tinja dari tikus yang obes dan normal telah menunjukkan bahawa mikrobiom obesiti tepu dengan gen enzim yang membolehkan lebih banyak kemerosotan polisakarida. Usus tikus lemak mengandung sejumlah besar produk akhir penapaian - sebatian asetik dan butirat asam, yang menunjukkan pemprosesan lebih dalam komponen makanan. Calorimetri (dari perkataan "kalori"!) Analisis sampel najis tikus mengesahkan ini: najis tikus ob / ob mengandungi kalori yang lebih sedikit daripada tikus jenis liar yang tidak sepenuhnya menyerap tenaga daripada makanan.

Sebagai tambahan kepada maklumat penting tentang komponen mikroba "obesitas, penulis dapat menunjukkan persamaan asas mikroflora pada orang gemuk dan tikus, yang membuka perspektif baru dalam kajian masalah berat badan berlebihan, dan mungkin penyelesaian masalah ini dengan" pemindahan "mikroflora yang sihat atau pembentukannya pada pesakit obes.

Diuji pada tikus

Dan dengan keletihan

Hakikat bahawa mikrobiota dapat mengawal metabolisme tuan rumah tidak lagi diragukan. Makmal penyelidikan Gordon, yang ditumpukan kepada masalah kelebihan berat badan, dibenarkan membuang jambatan untuk merawat penyakit metabolik. Antara mereka adalah jenis keletihan umum, yang menjejaskan kanak-kanak dari satu hingga empat tahun di negara-negara miskin dengan iklim tropika, seperti marasmus (kata ini hanya mempunyai hubungan bahasa dengan marasmus: marasmoz Yunani secara literal bermaksud keletihan, kepupusan) dan kwashiorkor (dalam bahasa salah satu puak Ghana kwashiorkor - "budak merah"). Kemunculan penyakit dikaitkan dengan kekurangan protein dan vitamin semasa peralihan dari penyusuan kepada makanan dewasa. Tetapi penyakit selektif memberi kesan kepada kanak-kanak yang saudara lelaki dan saudara perempuannya tidak mengalami masalah dengan peralihan kepada diet tradisional untuk rantau ini. Kajian telah menunjukkan bahawa mikroflora usus kanak-kanak yang sakit sangat berbeza dengan mikroflora ibu bapa mereka, dan juga dari mikroflora saudara lelaki yang sihat. Pertama sekali, terdapat ketiadaan hampir di dalam populasi usus Bacteroidetes dan dominasi spesies langka yang dipunyai oleh jenis Proteobacteria dan Fusobacteria. Selepas kanak-kanak yang sakit (dengan berhati-hati, supaya tidak berlebihan!) Makan makanan protein intensif, mikrobiota mereka kelihatan seperti biasa, seperti di kalangan saudara, dengan kelaziman Bactrotetes dan Firmicutes.

Kajian baru-baru ini tidak hanya mengubah pemahaman semasa mikroflora usus manusia, tetapi juga menyumbang kepada kemunculan konsep yang menganggap mikrobiota usus sebagai organ organ manusia multiselular tambahan. Sebuah organ terdiri daripada pelbagai garis sel yang mampu berkomunikasi antara mereka dengan organisme tuan rumah. Badan yang mengedarkan semula arus tenaga, melakukan tindak balas fisiologi yang penting, perubahan di bawah pengaruh alam sekitar dan regenerasi diri apabila perubahan disebabkan oleh keadaan luaran. Meneruskan kajian "organ bakteria" boleh dan harus membawa kepada pemahaman tentang undang-undang fungsinya, pendedahan hubungannya yang halus dengan organisme tuan rumah dan, sebagai hasilnya, kemunculan kaedah baru memerangi penyakit manusia melalui rawatan sasaran disfungsi kedua-dua komponen metaorganisme.

16s analisis rna

Asid ribonomle ribosom (rRNA) adalah beberapa molekul RNA yang membentuk asas ribosom. Fungsi utama rRNA adalah untuk menjalankan proses terjemahan - membaca maklumat dari mRNA menggunakan molekul penyesuai tRNA dan pemangkin pembentukan ikatan peptida antara asid amino yang dilampirkan kepada tRNA.

Kandungan

Subjenis Ribosom dan Tata RRNA

Pada gambar mikroskopik elektron ribosom utuh, ternyata bahawa mereka terdiri daripada dua sub-partikel dengan saiz yang berbeza.

Nisbah masukan dari subpartikel adalah

2: 1; orang ramai pula dinyatakan dalam pemalar pemendapan langsung yang diukur secara langsung (kadar pemendapan dalam unit Svedberg, S) semasa ultracentrifugasi, adalah parameter ini yang membentuk asas tatanan rRNA dan, ribosom dan subkategori ribosom: jenis penamaan digunakan

Contohnya, RNA ribosomal prokariot dengan pekali sedimentasi 16 unit Svedberg ditetapkan sebagai rRNA 16S.

Oleh kerana pekali pemendapan bergantung bukan hanya pada berat molekul, tetapi juga pada bentuk zarah, pekali sedimentasi semasa pemisahan adalah bukan aditif: contohnya, ribosom bakteria dengan jisim molekul

3 * 10 6 Dalton mempunyai pekali sedimentasi 70S, yang ditetapkan sebagai 70S dan memisahkan subunit 50S dan 30S:

Subunit ribosomal masing-masing mengandungi satu molekul rRNA panjang-panjang, iaitu jisim

1/2 - 2/3 jisim subkumpulan ribosom, oleh itu, dalam kes ribosom 70S bakteria, subunit 50S mengandungi 23S rRNA (panjang

3000 nukleotida) dan subunit 30S mengandungi 16S rRNA (panjang

1500 nukleotida); Sebagai tambahan kepada rRNA "panjang", subunit ribosom besar juga mengandungi satu atau dua rRNA "pendek" (rRNA 5S subunit ribosom bakteria 50S atau 5S dan 5.8S rRNA daripada subunit eukariota ribosom yang lebih besar).

Sintesis

RNA ribosomal membentuk sebahagian besar (sehingga 80%) daripada jumlah RNA selular; jumlah rRNA memerlukan transkripsi yang kuat dari gen pengkodannya. Keamatan ini disediakan oleh sejumlah besar salinan pengekodan gen rRNA: dalam eukariota, terdapat dari beberapa ratus (

200 dalam ragi) kepada puluhan ribu (untuk pelbagai kapas, 50-120 ribu salinan dilaporkan) daripada gen yang dianjurkan dalam susunan berulang.

Pada manusia, pengekodan gen rRNA juga dianjurkan ke dalam kumpulan pengulangan tandem yang terletak di kawasan pusat kromosom pendek 13, 14, 15, 21, dan 22.

Mereka disintesis oleh RNA polimerase I dalam bentuk molekul panjang RNA pre-ribosom, yang dipotong menjadi RNA berasingan yang membentuk asas ribosom. Dalam bakteria dan archaea, transkrip awal biasanya mengandungi 16S, 23S dan 5S rRNA, di mana urutan pra-rRNA dipadam. Biasanya antara 16S dan 23S rRNA gen terletak satu atau lebih gen tRNA; jadi, dalam E. coli, transkrip awal kumpulan gen tersebut mempunyai urutan berikut:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Transkrip sedemikian dipecahkan kepada serpihan pra-rRNA dan tRNA oleh enzim ribonuclease III.

Dalam eukariota, 18S, 5.8S dan 25/28 rRNA disalin bersama dengan RNA polimerase I, manakala gen rRNA 5S disalin dengan RNA polimerase III.

Dalam eukariota, tapak penumpuan gen yang mengodkan rRNA biasanya kelihatan dalam nukleus sel, kerana pengumpulan ribosom subunit di sekelilingnya, yang segera dipasang. Kelompok-kelompok ini juga berwarna dengan pewarna sitologi dan dikenali sebagai nukleolus. Oleh itu, kehadiran nukleoli adalah ciri bukan untuk semua peringkat kitaran sel: semasa pembahagian sel dalam prophase, nukleolus dipisahkan, kerana sintesis rRNA digantung dan dibentuk semula pada akhir telofase apabila sintesis rRNA diteruskan.

Analisis perbandingan rRNA pro dan eukariotik

RNA ribosom (seperti ribosom) prokariot dan eukariota berbeza antara satu sama lain, walaupun ia menunjukkan persamaan yang ketara antara kawasan urutan. Ribosom prokariotik 70S terdiri daripada subunit 50S besar (dibina berdasarkan dua molekul rRNA - 5S dan 23S) dan subunit kecil 30S (dibina berdasarkan 16S rRNA). Raksasa eukariotik 80S terdiri daripada subunit 60S besar (dibina berdasarkan tiga molekul rRNA - 5S, 5.8S dan 28S) dan subunit 40S kecil (dibina berdasarkan rRNA 18S).

Menggunakan maklumat urutan

Maklumat mengenai rRNA organisma tertentu digunakan dalam perubatan dan biologi evolusi.

  • Gen rRNA adalah salah satu gen yang paling konservatif (tidak berubah). Oleh itu, kedudukan sistematik organisma dan masa pemisahan dengan spesies dekat dapat ditentukan berdasarkan analisis persamaan dan perbezaan dalam urutan rRNA.
  • RRNA adalah sasaran untuk sejumlah besar antibiotik, beberapa di antaranya digunakan dalam amalan klinikal, baik untuk menekan pertumbuhan bakteria (antibiotik yang mengikat ribosom prokariotik) dan untuk merawat penyakit manusia (antibiotik yang mengikat ribosom eukariotik). Kumpulan pertama termasuk chloramphenicol, erythromycin, kasugamycin, mikrocoxin, spectinomycin, streptomycin, thiostrepton. Untuk kedua hygromycin B, paromomycin.

Artikel Yang Berkaitan Hepatitis